商品屬性：

產品名稱：輔酶ⅠNAD(H)含量生化檢測試劑盒

規格：100管/48樣 50管/24樣 

貨號 : EY-01S11

測試方法:微量法　可見分光光度法　　

分類：輔酶Ⅰ系列

商品詳情：

測定意義 輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環（TCA）的主要氫受體，生成的NADH經呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成ATP的同時，形成大量的ROS，同時NADH再生為NAD+。糖、脂、蛋白質三大代謝物質分解中的氧化反應絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于評價糖酵解和TCA循環的強弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD+比值說明細胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環。另外，NAD+降解產物對細胞信號傳導、代謝和基因表達等具有重要的調控作用。

測定原理  分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍（MTT）為甲瓚，在570nm下檢測吸光值；而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進一步采用MTT還原法檢測。 

需自備的儀器和用品 

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

ADH測定操作：

1. 分光光度計預熱30 min，調節波長到340 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑三在25℃水浴中保溫30 min。

3. 在1mL石英比色皿中依次加入100μL樣本上清液、800μL試劑三和100μL試劑四，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時吸光值，分別記為A1和A2?！鰽測定管=A1-A2。

測定步驟：

1、分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2、將試劑二在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

3、操作表：

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，混勻后立即在340 nm波長下記錄初始吸光度A1和反應1min后的吸光度A2，計算ΔA=A1-A2。

注意：若A1-A2大于0.5，需將樣本用提取液稀釋，使A1-A2小于0.5，可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數。

NAD-MDH活力單位的計算：

1、血清（漿）NAD-MDH活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=6430×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NAD-MDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（2000×V樣÷V樣總）÷T=3.215×ΔA

V反總：反應體系總體積，8×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，1 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；2000：細胞或細菌總數，2000萬。

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