商品屬性：

產(chǎn)品名稱：ADPG焦磷酸化酶(AGP）生化檢測(cè)試劑盒

規(guī)格：100管/96樣 50管/48樣 25管/24樣

貨號(hào) : EY-01S1208

測(cè)試方法:微量法　紫外分光光度法　紫外分光光度法　

分類：脂肪酸代謝系列

商品詳情：

測(cè)定意義

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化糖-1-磷酸與ATP反應(yīng)生成淀粉合成的直接前體ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。

測(cè)定原理

AGP催化的逆向反應(yīng)生成G1P，在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和6-磷酸糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸糖酸和NADPH，340nm下測(cè)定NADPH增加速率，即可計(jì)算AGP活性。

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

粗酶液提取：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。16000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；16000g， 4℃離心20min，取上清液置冰上待測(cè)。

3、血清等液體：直接測(cè)定。

ADH測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三在25℃水浴中保溫30 min。

3. 在1mL石英比色皿中依次加入100μL樣本上清液、800μL試劑三和100μL試劑四，迅速混勻后于340nm測(cè)定吸光值變化，分別記錄15s和75s時(shí)吸光值，分別記為A1和A2。△A測(cè)定管=A1-A2。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑二在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

3、操作表：

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，混勻后立即在340 nm波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1和反應(yīng)1min后的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意：若A1-A2大于0.5，需將樣本用提取液稀釋，使A1-A2小于0.5，可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

NAD-MDH活力單位的計(jì)算：

1、血清（漿）NAD-MDH活力的計(jì)算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=6430×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NAD-MDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（2000×V樣÷V樣總）÷T=3.215×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，8×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000萬(wàn)。

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